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蛋白质技术专题:凝胶过滤层析实验
点击次数:64 发布时间:2019-02-25

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法,主要是根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖类物质,使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

实验方法
蛋白质的凝胶过滤分离 
实验材料 蛋白质  
试剂、试剂盒 凝胶过滤缓冲液  
仪器、耗材 布氏漏斗 凝胶过滤层析柱 分光光度计 
实验步骤
1.  如果凝胶过滤的介质是干粉,则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。
2.  在远离过往通道及直接光照的恒温环境,将层折柱垂直安装在稳固的实验室支架上。
3.  用一注射器将凝胶过滤缓冲液从柱子的输出管注入柱子,至缓冲液达到柱子支持体平面之上,注射器留在输出端以堵住柱子。
4.  沿着一根顺柱子内壁而放的玻璃棒将凝胶混悬物倒入柱子至所设高度,再小心往凝胶顶部加入1 cm 高的一层缓冲液,并连接缓冲液贮存容器,取去堵着柱子输出管的注射器,用2~3倍柱床体积的缓冲液请洗柱子。
5.  流尽柱子凝胶顶部上面的缓冲液、关闭其输出管。
6.  加入相当于柱床体积1%~5%的蛋白质样品。开放输出管,让样品流进柱床,凝胶上面的柱子内壁以缓冲液冲洗。
7.  在凝胶顶上用吸管加入1 cm 高的缓冲液层,重新与缓冲液贮存容器连接,开始洗脱。
8.  分部收集流出液。每分部相当于1%总柱床体积,分别测每个分部的A280,并各取小份样品测生物活性,选出有活性的分部用SDS-PAGE检测所含蛋白质的数量和质量,合并含目标蛋白的分部。
9.  用2~3个柱床体积的凝胶过滤缓冲液洗柱,柱子保存在含0.02%叠氮钠的缓冲液中,柱于可无限次地使用。
收起   
注意事项 切勿用磁力搅拌器搅拌,让凝胶颗粒自然沉降,吸去或倾去不沉降的细小颗粒,或者根据厂商的使用指南进行处理,对预溶胀的凝胶,在布氏漏斗或玻璃烧结漏斗中用大量缓冲液冼去防腐剂,重悬于等体积的凝胶过滤缓冲液,倾入细颈过滤瓶中,在使用前进行脱气。 

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